SURE Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

E. coli B e14-(mcrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcCumuC::Tn5(Kanr) uvrC [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

SURE 電擊感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。真核生物 DNA 存在較多“十字型"、“Z字型"等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種 DNA 結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行克隆時(shí)易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)其進(jìn)行重組，刪除等破壞，導(dǎo)致很難對(duì)這類(lèi) DNA 進(jìn)行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問(wèn)題：此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞，并且 (mcrA-,mcrCB-, mcrF-, mrr-,hsdR-)這些限制性突變的存在賦予此菌株無(wú)法對(duì)外源DNA 進(jìn)行標(biāo)記、限制，提高了外源甲基化DNA 的克隆效率，同時(shí)具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變，增強(qiáng)了外源 DNA 的穩(wěn)定性。存在于F′ 因子上的 lacIqZΔM15 基因使此菌株可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；KanR，TetR賦予菌株ka那mei素和四環(huán)素抗性。SURE電擊感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>0.5×1010 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明：

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘，待其瀝干水分，正置 5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5分鐘充分降溫。

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；  B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，請(qǐng)用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過(guò)100ng/μl，體積不超過(guò) 5μl/50μl 感受態(tài)。

三、用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

四、啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此為 BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl不含抗生素的無(wú)菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。37℃，225rpm 復(fù)蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑 15cm培養(yǎng)皿2-5 個(gè)）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17 小時(shí)。

注意事項(xiàng)：

（一）加入DNA 時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

（二）電擊感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

（三）當(dāng)DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

（四）電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

（五）若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

（六）對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化， 最好轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA 濃度不超過(guò) 100ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

（七）混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)不可用孔徑過(guò)小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應(yīng)剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過(guò)猛，以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

（八）電擊感受態(tài)細(xì)胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。